1500年，乌兹别克首领马黑麻昔班尼汗占领撒麻耳干，建立昔班尼王朝。不久，便出兵进攻东察合台汗国。阿黑麻亲率军队前去支援。但兄弟二人均被昔班尼汗打败，并成了俘虏。其后，阿黑麻长子满速儿成为东察合台汗国的大汗。为了巩固自己的统治地位，满速儿无情地镇压了自己的几个兄弟，其中萨亦德和哈里勒被迫逃亡。1514年，萨亦德在印度莫卧儿王朝巴布尔大帝的支持下，返归南疆，打败了和田统治者阿“巴绊乞儿，相继攻占英吉萨尔、叶尔羌、和田等地，成为今南疆西部的统治者，建立“萨亦德王朝”，史称“叶尔羌汗国”。1516年，萨亦德与满速儿弟兄会晤，双方和解。萨亦德汗向满速儿汗称臣，仍然承认其大汗地位，维持东察合台汗国表面上的统一。
1533年萨亦德汗去世，其子拉失德继位。叶尔羌汗国脱离东察合台汗国，东察合台汗国实际上仅控制着焉耆、吐鲁番、哈密三个地区。1543年满速儿汗去世后，其子各据一方，互相争斗，纷纷依附于拉失德汗，东察合台汗国名存实亡。拉失德执政时期，历史学家写出了《拉失德史》，记载了当时天山南北各民族的历史。我国民族音乐的宝贵遗产大型音乐套曲《十二木卡姆》也产生在这一时期。1570年拉失德汗死后，叶尔羌汗国逐渐衰落。
15世纪初，明朝立哈密卫，并积极发挥其作用，与内地州县相似。哈密卫曾一度成为明朝政府接待西域各地使者的中间站。但在其后，随着明朝的日趋衰败，对哈密卫的控制也逐渐衰弱。
明朝曾派使臣李暹、陈诚等到西域，他们撰写了《西域番国记》和《西域行程记》，为明朝政府了解西域形势和制定政策提供了第一手资料。
15—16世纪，由于整个塔里木盆地周围地区在政治、经济、语言、文化和宗教方面的统一，生活在这一地区的原居民的回鹘化即维吾尔化过程最终完成。察合台汗国的蒙古人基本上都融合于维吾尔族之中。吐鲁番地区的汉族，哈密的回回、畏兀儿、哈喇灰也融合于维吾尔族。
这一时期，哈萨克、乌孜别克、柯尔克孜等民族也逐渐形成。14世纪末至15世纪初，钦察汗国(金帐汗国)分裂，从伏尔加河至额尔齐斯河称“白帐汗国”，仍由成吉思汗长子术赤的后裔统治。15世纪中叶，白帐汗国被瓦刺击败，其所属乃蛮、克烈、篾儿乞等部的部分民众在首领克烈和扎尼别克二人率领下，迁徙至楚河流域。东察合台也先不花汗将其安排在楚河附近的库齐巴什地方，这些人自称“哈萨克”。未迁徙仍留在原地的游牧居民则自称为“乌孜别克”。15世纪后半期，哈萨克的人口有所增加，牧地扩大。原白帐汗国属下的乌孜别克人继续迁入楚河流域，与哈萨克人汇合。也先不花汗去世后，东察合台汗国的七河和伊犁河流域的乌孙、杜拉特(朵豁刺惕)、札刺亦儿等部落也逐渐融合于哈萨克，哈萨克人的牧地扩展到了巴尔喀什湖以东以南地区。1511—1523年，哈斯木汗完全统一了哈萨克各部，形成了地域广大的哈萨克汗国。其辖地南至锡尔河流域，东南至楚河、塔拉斯河、卡腊塔拉河、伊犁河诸河流域，东北至巴尔喀什湖东南，西至玉雅克河流域。首都从锡戛那克迁到突厥斯坦城。
16世纪初，昔班尼在汗位时，乌孜别克汗国复兴，并达到鼎盛阶段。1500年，昔班尼汗率军南征，先后占领布哈拉、撒马尔罕、讹迹干、塔什干、巴尔赫等地，灭亡帖木儿帝国。乌孜别克人进入中亚农业区并建立政权后，与当地居民融合，逐渐成为乌孜别克族。
1428年，歪思汗去世，长子羽奴思与次子也先不花争夺汗位，结果也先不花称汗，羽奴思逃亡帖木儿帝国。也先不花汗多次出兵，攻掠帖木儿帝国。1456年，帖木儿帝国护送羽奴思东归，羽奴思攻占费尔干至阿克苏和伊塞克湖以南地区后，遂自立为汗，东察合台汗国因此而又分为南、北两个部分。1462年，也先不花死，羽奴思攻占吐鲁番等地，统一东察合台汗国，并与明朝争夺哈密。1487年，羽奴思汗去世，长子马黑木在塔什干继位，统有汗国西部领土。次子阿黑麻汗控制着从阿克苏到吐鲁番的广大地区，并占据哈密。
15—16世纪，柯尔克孜族人大批进入新疆。柯尔克孜，汉代称坚昆，唐代称黠戛斯，元代称吉利吉思，一直居住在叶尼塞河上游地区。瓦刺强盛起来以后，吉利吉思人受到瓦刺人的侵袭，被迫西迁。他们首先越过阿尔泰山，南穿准噶尔盆地，到达伊塞克湖周围和伊犁河上游地区，其中一部分又南逾天山，达乌什、喀什噶尔及其以西地区。西迁的吉利吉思人依附于东察合台汗国，并逐渐信仰了伊斯兰教。萨亦德汗建立叶尔羌汗国时，吉利吉思人竭力援助。
汉代，新疆地区的古代民族主要有塞、月氏(音：肉支r6uzhi)、乌孙、羌、匈奴和汉人。
塞人，在西方史籍